免疫熒光的實(shí)驗(yàn)主要步驟包括細(xì)胞片制備、固定及通透（或稱為透化）、封閉、抗體孵育及熒光檢測(cè)等。細(xì)胞片制備（通俗的說(shuō)法是細(xì)胞爬片）是免疫熒光實(shí)驗(yàn)的步，細(xì)胞片的質(zhì)量對(duì)實(shí)驗(yàn)的成敗至關(guān)重要，原因很簡(jiǎn)單，如果發(fā)生細(xì)胞掉片，一切都無(wú)從談起。這一步關(guān)鍵的是玻片的處理以及細(xì)胞的活力，有人根據(jù)成功經(jīng)驗(yàn)總結(jié)出許多有益的細(xì)節(jié)或小竅門(mén)，非常值得借鑒。固定和通透步驟重要的是根據(jù)所研究抗原的性質(zhì)選擇適當(dāng)?shù)墓潭ǚ椒?，合適的固定劑和固定程序?qū)τ讷@得好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是非常重要的。
免疫熒光中的封閉和抗體孵育與其他方法（如ELISA或WesternBlot）中的相同步驟是類(lèi)似的，重要的區(qū)別在于免疫熒光實(shí)驗(yàn)中要用到熒光抗體，因此必須謹(jǐn)記避光操作，此外，抗體濃度的選擇可能更加關(guān)鍵。后需要注意的是，標(biāo)記好熒光的細(xì)胞片應(yīng)盡早觀察，或者用封片劑封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因標(biāo)記蛋白解離或熒光減弱而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
由于操作步驟比較多，同時(shí)在分析結(jié)果時(shí)無(wú)法像WB那樣可以根據(jù)分子量的大小區(qū)分非特異性識(shí)別，所以要得到一個(gè)的
免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果，除了需要高質(zhì)量的抗體，以及對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行反復(fù)優(yōu)化外，還必須設(shè)立嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)對(duì)照?？傊?，免疫熒光實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞樣品處理、固定、封閉、抗體孵育到后的封片及觀察拍照，每步都非常關(guān)鍵，需要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)流程中每個(gè)步驟的質(zhì)量，才能終達(dá)到你的實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/div>
抗原抗體反應(yīng)，其具有高度的特異性。先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物，再用這種熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在細(xì)胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光（黃綠色或桔紅色），可以看見(jiàn)熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測(cè)定含量。
